细胞外囊泡（EVs）是细胞自然释放的细胞衍生颗粒，带有磷脂双分子层。这些EVs存在于血液、尿液等体液中，其特性如细胞起源、浓度、组成和功能均与特定疾病相关。因此，研究人员正积极探索EVs作为包括癌症和心血管疾病在内的生物标志物。然而，要将EVs有效地应用于生物标志物，需要建立可靠和可重复的测量方法。目前，EVs生物标志物研究面临的主要障碍是仪器之间以及不同单位间测量结果的不一致性，这严重阻碍了多中心研究的开展。多中心研究是进行临床生物标志物研究的必要条件。

为了改善数据的可比性，我们开发了一种具备与EVs物理特性相似的新参考材料和参考程序。新参考材料和程序的验证需要生物测试样品的支持，因此我们开发了一种人血浆EVs测试样品（PEVTES）。该样品i）与血浆中的亚细胞颗粒相似，ii）现成可用，iii）兼容于流式细胞仪，iv）稳定性良好。

方法方面，PEVTES的制备采用三例空腹供体血浆，利用血小板特异性（CD61）和红细胞特异性（CD235a）抗原以及乳黏附素抗体进行EV染色。随后通过大小排斥层析技术从血浆中分离染色后的EVs，旨在降低可溶性蛋白、脂蛋白以及未结合试剂的浓度。分离后，进一步过滤PEVTES以去除残余血小板，并使用冷冻保存剂如二甲亚砜（DMSO）、甘油或海藻糖进行稀释，最后在-80℃保存12个月。

在解冻后，我们使用校准的纳米流式细胞仪（Apogee A60-Micro）测量染色后的EV浓度。为了评估PEVTES的稳定性，我们在冷冻前及存放1、3、6和12个月后进行了流式细胞仪测量，包括流速、荧光信号和光散射信号的校准。PEVTES的各制备步骤包括人血浆的收集与制备、染色程序、尺寸排除层析，以及用料过滤去除残留的血小板。

在对PEVTES的稳定性进行测试时，我们发现，冷冻保存后的CD61+EVs样品在DMSO中保存12个月后，其测量浓度较新鲜材料下降了33%；而在甘油和海藻糖中的保存浓度分别增加了9%和6%。对CD235a+EVs的测量显示，在DMSO、甘油和海藻糖中的浓度分别比新鲜起始材料降低了约70%、23%和15%。乳酸粘附素+EV的浓度在DMSO中下降了23%，在甘油中下降28%，而在海藻糖中下降19%。

综上所述，PEVTES证明了自身在以下方面的优势：1）与血浆中的亚细胞颗粒相似；2）操作简便；3）与纳米流式细胞术兼容；4）保持良好的稳定性。因此，所开发的PEVTES是验证新开发参考物和程序的理想选择。要获取更多与生物医学相关的信息，请访问金年会金字招牌至上网站，以了解行业最新动态。